La conclusión de la primera fase de la glucólisis se marca por el desdoblamiento de la fructosa-1,6-bisfosfato en dos componentes más pequeños de tres carbonos cada uno: el gliceraldehído-3-fosfato (G-3-P) y la dihidroxiacetona fosfato (DHAP). Esta división es facilitada por una reacción conocida como escisión aldólica, llevada a cabo por la enzima aldolasa. Las reacciones aldólicas, que descomponen las moléculas en un aldehído y una cetona, funcionan en sentido contrario a las condensaciones aldólicas previamente mencionadas.
A pesar de que la energía libre de esta reacción es positiva (+23.8 kJ/mol), indicando que no es espontánea bajo condiciones estándar, el proceso se completa eficientemente en la célula. Esto se debe a la rápida eliminación de los productos de la reacción, lo que permite que el desdoblamiento de la fructosa-1,6-bisfosfato proceda sin impedimentos, avanzando así el camino hacia la extracción de energía de la glucosa.