En este paso de la glucólisis, la energía se recupera a través de la síntesis de ATP. La fosfoglicerato quinasa actúa como catalizador en la transferencia de un grupo fosforilo de alta energía desde el glicerato-1,3-bisfosfato hacia el ADP, generando ATP:
Este proceso es un claro ejemplo de fosforilación a nivel de sustrato, un mecanismo mediante el cual se sintetiza ATP aprovechando la energía liberada por la transferencia de un grupo fosforilo de un sustrato con alto potencial de transferencia energética. Dado que cada molécula de glucosa se divide para formar dos moléculas de glicerato-1,3-bisfosfato, se producen dos moléculas de ATP por cada glucosa que entra en la ruta, compensando así la inversión energética inicial requerida para añadir grupos fosfato a la glucosa al comienzo de la glucólisis. Este paso no solo equilibra la balanza energética sino que también establece las bases para cualquier ganancia neta de ATP a lo largo del proceso.